Enzymatischer Nachweis der Tiefenabhängigkeit der Vernetzungswirkung von Riboflavin/UVA an der Hornhaut

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Abstract
Die Behandlung des Keratokonus mit Riboflavin/UVA beruht auf einer signifikanten Verfestigung der Hornhaut durch photochemische Vernetzung der Kollagenmoleküle. Es soll untersucht werden, bis zu welcher Tiefe in der Hornhaut eine Vernetzungswirkung biochemisch nachweisbar ist. Von 20 enukleierten Schweineaugen wurden 10 mit Riboflavin/UVA (370 nm, 3 mW/cm2; 30 min) behandelt und 10 Augen dienten als Kontrollgruppe. Mit einem Mikrokeratom wurden jeweils von einem Auge nacheinander zwei Flaps von 8 mm Durchmesser und von 200 μm Dicke geschnitten. Es resultierten also ein oberflächlicher Flap (0–200 μm) und ein tiefer Flap (200–400 μm), welche anschließend in eine Kollagenaselösung (NaCl-lösung + Kollagenase A; 1:1) gegeben wurden. Zur Charakterisierung des enzymatischen Abbaues der Hornhäute in Kollagenase wurden die Flap-Oberflächen täglich digital ausgemessen. Die Resistenz des kornealen Kollagens gegenüber enzymatischen Abbauprozessen lag bei den ersten (oberflächlichen) behandelten Flaps signifikant (p=0,001) höher im Vergleich zu den zweiten (tiefere Schicht) behandelten Flaps und zu den Kontrollflaps. Selbst die zweiten behandelten Flaps zeigten noch ein signifikantes Widerstandsverhalten (p=0,02) gegenüber den unbehandelten Flaps. Die Halbierungszeiten betrugen bei den behandelten Flaps 220 h für die ersten und 80 h für die zweiten Flaps. Die unbehandelten Flaps zeigten eine gemeinsame Halbierungszeit von 50 h. Aus den biochemischen (enzymatischen) Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung der Hornhaut mit Riboflavin und UVA nicht nur eine signifikante Kollagenvernetzung der oberen Hornhautschicht von ca. 200 μm Dicke bewirkt, sondern auch in den folgenden 200 μm der Hornhaut. Diese räumlich begrenzte Vernetzungswirkung lässt sich aus dem Absorptionsverhalten der mit Riboflavin behandelten Hornhaut für UVA erklären. 65% der UVA-Strahlung werden in den ersten 200 μm absorbiert und in den weiteren 200 μm nur noch 25–30%. It has been shown that the treatment of keratoconus with riboflavin/ultraviolet A (UVA) causes significant stiffening of the cornea due to cross-linking. The aim of this study was to evaluate how deep the mechanical stabilization after collagen cross-linking could be shown biochemically. Ten out of 20 enucleated porcine eyes were treated with riboflavin as a photosensitizer and UVA (370 nm, 3 mW/cm², 30 min). The other 10 eyes served as controls. With a Microkeratom device, two flaps with a thickness of 200 µm and a diameter of 8 mm were cut off from each eye and put in a collagenase solution (NaCl plus collagenase A, 1:1). The surfaces of the flaps were measured digitally every day to characterize the dissolving behavior. The resistance (regarding corneal collagen against enzymatic digestion) of the treated superficial flaps was considerably higher (p=0.001) compared to those that were cut secondarily and to the control flaps. But even the flaps from deeper layers showed a significant increase in resistance (p=0.02) compared with the untreated flaps. The half-life of the surfaces of the treated superficial flaps was 220 h; of those cut secondarily, it was 80 h. Both untreated flaps had a half-life of 50 h. The biochemical study showed that the treatment of the cornea with riboflavin/UVA leads to significant collagen cross-linking not only in the anterior slice of 200 µm but also in the following 200 µm. This locally limited cross-linking effect may be explained by the absorption behavior for UVA of the riboflavin-treated cornea; 65% of UVA irradiation is absorbed in the first 200 µm and only 25–30% in the next 200 µm. Therefore, deeper-lying structures and especially the endothelium are not affected.

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