Jörg Pintaske

Zielsetzung: Im Gegensatz zum Nachweis von Fernmetastasen und Lymphknoten-Metastasen ist die Detektion von Intransit-Metastasen bei malignen Melanomen ein bis heute ungelöstes diagnostisches Problem. Im Rahmen der Ausbreitungsdiagnostik ist die Aufgabe der Bildgebung die frühzeitige Erkennung neu aufgetretener Metastasierungen. Dies ist für die Prognose und das weitere therapeutische Vorgehen von entscheidender Bedeutung. Um die Darstellung auch kleiner Zellcluster maligner Melanomzellen mittels MR zu erforschen, wurden die Signaleigenschaften von Melanom-Zellen nach Inkubation mit einem eisenhaltigen MR-Kontrastmittel (Resovist^®) untersucht. Material und Methoden: Adhärent wachsende SK-Mel28 Melanomzellen wurden mit Resovist^® im Kulturmedium unter Variation von Konzentration, Zellzahl und Inkubationszeit markiert. Der Eisengehalt pro Zelle wurde bestimmt. Für die MR-Untersuchungen wurden 500 bis 1 Million Zellen kugelförmig in ein Agarphantom eingegossen. Die intra- und extrazelluläre Verteilung des Kontrastmittels wurde licht- und elektronenmikroskopisch dokumentiert. Zur Optimierung der Eisenaufnahme wurde das Kontrastmittel mit liposomalem Transfektionsreagenz zu einem Liposomen/KM-Komplex verpackt. Die gewonnenen Agarphantome wurden bei 1.5 T (Magnetom Sonata, Siemens, Forchheim) und bei 3.0 T (Magnetom T.I.M. Trio, Siemens) unter Verwendung hochauflösender Spulen mit eisensensitiven GRE-Sequenzen untersucht. Ergebnisse: Melanomzellen lassen sich schnell und effektiv mit eisenhaltigem Kontrastmittel beladen. Dabei nehmen die Zellen bei längerer Inkubation Eisen auf, bei kürzerer Inkubationszeit wird das Eisen stabil außen an die Zellmembran gebunden. Die Eisenaufnahme in Form von KM ist auch abhängig von der Konzentration des Kontrastmittels im Medium. Eine maximale Fe-Aufnahme von 90 pg Eisen je Zelle konnte erzielt werden. Die kernspintomographischen Untersuchungen mit 1.5 und 3T ergaben, unter den hier verwendeten Bedingungen, eine Nachweisgrenze von 1 000 Zellen. Durch Verwendung von DOSPER als Transfektionsagenz lässt sich, bei gleicher Eisenbeladung, die Inkubationszeit in der Zellkultur von 24 auf 4 Stunden und die Eisenkonzentration im Medium ebenfalls um das sechsfache verringern. Die Vitalität und Aktivität der Zellen ist dabei nicht eingeschränkt. Schlussfolgerung: Eisenhaltiges MR Kontrastmittel eignet sich im in-vitro Modell zur Detektion kleiner Intransit-Metastasen, eine in-vivo Eignung im Tiermodell muss noch untersucht werden.

The ability of magnetic resonance imaging (MRI) to visualize magnetically labelled cells has attracted much attention for revealing cellular events. The present study addressed the geometry and the extension of signal voids in static signal dephasing MRI induced by aggregations of magnetically labelled cells by means of a three-dimensional numerical model. The magnetic field distortions around spherical cell aggregations were treated as equivalent to those of a magnetic dipole. Intravoxel signal dephasing and respective signal voids attributed to these field inhomogeneities were computed. Effects of cell concentration on the signal void in the plane of view were evaluated in terms of dipole magnetization. Signal void characteristics were scrutinized systematically for fundamental sequence parameters including echo time, voxel size and plane-of-view orientation. For all variables examined, significant changes in geometry as well as extension of signal voids were demonstrated. The results are of crucial importance to optimize and interpret MR images with regard to spatial accuracy as well as sensitivity to detect aggregations of labelled cells in vitro or even in vivo. It is anticipated that the dependence of the extension of signal voids on the local magnetization may be valuable for quantifying labelled cells.

In the current study the effect of increasing concentrations of superparamagnetic iron oxide labeled cells on the MRI signal decay at magnetic field strengths of 0.2, 1.5, and 3 T was evaluated. The spin echo and gradient echo cellular transverse relaxivity was systematically studied for various concentrations (N = 1, 5, 10, 20, 40, and 80 cells/μl_gel) of homogeneously suspended SH U 555A labeled SK-Mel28 human melanoma cells. For all field strengths investigated a linear relationship between cellular transverse relaxation enhancement and cell concentration was found. In the spin echo case, the cellular relaxivities [i.e., d(ΔR ₂)/dN] were determined to 0.12 s⁻¹ (cell/μl)⁻¹ at 0.2 T, 0.16 s⁻¹ (cell/μl)⁻¹ at 1.5 T, and 0.17 s⁻¹ (cell/μl) at 3 T. In the gradient echo case, the calculated cellular relaxivities (i.e., d(ΔR ₂ ^* )/dN) were 0.51 s⁻¹ (cell/μl)⁻¹ at 0.2 T, 0.69 s⁻¹ (cell/μl)⁻¹ at 1.5 T, and 0.71 s⁻¹ (cell/μl)⁻¹ at 3 T. The proposed preparation technique has proven to be a simple and reliable approach to quantify effects of magnetically labeled cells in vitro. On the basis of this quantification well suited tissue specific models can be derived.

We sought to determine the relaxivity and accurate relaxation rates of Gd-DTPA, Gd-BT-DO3A, and Gd-BOPTA at 0.2, 1.5, and 3 T in human blood plasma. Contrast media concentrations between 0.01 and 16 mM in human plasma were used for relaxation measurements. The R1 and R2 relaxation rates and r1 and r2 relaxivities were determined. Gd-BOPTA produced the highest relaxation rates and relaxivities at all field strengths. The r1 and r2 values for Gd-BOPTA were 107–131% and 91–244% higher than for Gd-DTPA, respectively, and 72–98% and 82–166% higher than for Gd-BT-DO3A. Higher field strengths resulted in lower values of R1, R2, and r1 for all contrast agents tested and of r2 for Gd-DTPA and Gd-BT-DO3A. A linear dependence of R1 and R2 on concentration was found for Gd-DTPA and Gd-BT-DO3A and a nonlinear dependence for Gd-BOPTA for concentrations larger than 1 mM. The r1 and r2 relaxivity of Gd-BOPTA increased with decreasing concentration. Gd-BOPTA demonstrates the highest longitudinal r1 at all field strengths, which is ascribable to weak protein interaction. The R2/R1 ratio increases at higher field strength only for Gd-BOPTA, hence very short echo times are required for Gd-BOPTA to benefit from the higher longitudinal relaxivity.

Cells loaded with superparamagnetic iron oxide (SPIO) cause relatively strong magnetic field distortions, implying that field position effects of neighboring SPIO loaded cells have to be accounted for. We treated SPIO loaded cells as magnetic dipoles in a homogeneous magnetic field and computed the 3D frequency distribution and the related signal decay using a numerical approach under static dephasing conditions. The volume fraction of dipoles was kept constant for all simulations. For larger randomly distributed magnetic dipoles we found a non-Lorentzian frequency distribution and a non-monoexponential signal decay whereas, for smaller dipoles, the frequency distribution was more Lorentzian and the signal decay was well fitted monoexponentially. Moreover, based on our numerical and experimental findings, we found the gradient echo signal decay due to a single SPIO labeled cell to be non-monoexponential. The numerical approach provides deeper understanding of how the spatial distribution of SPIO loaded cells affects the MR signal decay. This fact has to be considered for the in vivo quantification of SPIO loaded cells, implying that in tissues with different spatial distributions of identical SPIO concentrations, different signal decays might be observed.

Zielsetzung: Das Anliegen der Studie war, klinische MR-Bildgebung hinsichtlich ihres Potentials zur Darstellung und Quantifizierung lokaler Zellpopulationen zu validieren und Grundlagen für ein in-vivo Monitoring geeigneter, markierter Zellen zu legen. Um in-vivo Verhältnisse zu simulieren, sollten neue Präparationstechniken entwickelt werden. Insbesondere der Zusammenhang zwischen Zellzahl, Areal der Zellansammlung und Ausdehnung der messbaren Feldstörung soll hier phänomenologisch erfasst und quantitativ beschrieben werden. Es sollten Rückschlüsse gezogen werden, inwieweit funktionelle Gesetzmäßigkeiten existieren und wie diese passend zu formulieren sind. Die messtechnisch begründeten Limitationen der exakten Größe und Lokalisation der Zellpopulation sollen mittels dieser Studie aufgezeigt werden. Material und Methoden: SK-Mel28 Melanomzellen und hämatopoetische KG-1a Zellen wurden bei verschiedenen Resovist®-Konzentrationen im Kulturmedium (Inkubationszeit 48h) markiert. Der mittlere Eisengehalt pro Zelle wurde mit Atom-Absorptionsspektroskopie bestimmt. Als Trägersubstanz für verschiedene Verdünnungen super-paramagnetischer Kontrastmittel und Zellkulturen (SK-Mel28, KG-1a) wurde eine Agarmatrix verwendet. In diese wurden 750–15.000 ng Eisen bzw. 25.000–1.000.000 SK-Mel28 Zellen eingebracht. Die Eisenmenge wurde auf verschiedene Volumina von 4–20µl verteilt. Die Untersuchungen erfolgten an einem klinischen MR-Scanner der Feldstärke 3 Tesla (Magnetom Trio, Siemens). Als Sende- und Empfangsspule wurde eine Handgelenkspule verwendet. Eine 3D-Bildgebungssequenz (FLASH, TR 35 ms, Flipwinkel 20°) wurde mit isotropen Auflösungen von 0.25 bis 0.60mm verwendet. Die Echozeit wurde von 5 ms bis 25 ms variiert. Die Signalauslöschung wurde quantitativ beschrieben durch die Ausdehnung in Richtung des Magnetfeldes. Ergebnisse: Sowohl die adhärenten SK-Mel28 als auch die KG-1a Zellen nahmen Resovist auf (Abb. 1). Zusätzlich lagerte sich Resovist in Klumpen von außen stabil an die Zellmembran an (Abb. 2). Die Ausdehnung der Signalauslöschung zeigte eine annähernd logarithmische Charakteristik (Abb. 3) in Abhängigkeit von der Magnetisierung (Eisen/Volumen): Sie stieg oberhalb eines Schwellenwertes zunächst stark an und flachte bei hohen Mengen an Resovist bzw. Zellmengen deutlich ab. In Abhängigkeit von der Eisenmenge m konnte diese am passendsten beschrieben werden durch D(m)=D₁₀log₁₀(m/m₀). Hierin bezeichnet m₀ die theoretische Nachweisgrenze bei D=0 und D₁₀ die Zunahme des Durchmessers der Ausdehnung bei Verzehnfachung der Eisenmenge. Beim direkten Einbringen von Resovist lag die theoretische Nachweisgrenze bei ungefähr 80 ng Fe/10µl. Die praktisch zu realisierende Nachweisgrenze war bei annähernd 800 ng Fe/10µl anzusetzen. Bei SK-Mel28 Zellen lag die theoretische Nachweisgrenze bei ca. 10.000 Zellen/10µl, praktisch konnten 25.000 Zellen/10µl noch erfasst werden. Die Ausdehnung der Signalauslöschung ist von der realisierten Auflösung und Echozeit abhängig. Mit größeren Volumenelementen und längerer Echozeit tendierte die Feldverzerrung zuzunehmen. Ein Maximum wurde bei TE 25 ms und 0.6mm isotroper Auflösung erreicht. Diskussion: Die Detektion magnetisch markierter Zellen mit MRT ist möglich, die Quantifizierung ist aber kritisch zu beurteilen. Der Nachweis ist am sichersten über eine Signalauslöschung in einem zusammenhängenden Gebiet zu erbringen. Der Durchmesser der Signalauslöschung ist dabei eine logarithmische Funktion der Magnetisierung (Eisen/Volumen). Die Charakteristik ermöglicht eine Quantifizierung von Zellklustern und Beladung. Zum Nachweis kleiner Zellmengen ergibt sich ein Optimum bei TE 20 ms und 0.3mm isotroper Auflösung. Die tatsächliche Detektionsschwelle war größer als der durch Regression ermittelte Wert. Die Nachweisgrenze der lokalen Eisenmenge der Zellkulturen ist höher als durch direktes Einbringen von Resovistlösung. Wir vermuten, dass die Zellen in-vitro nicht ideal homogen verteilt sind, was die relaxationsverstärkenden Eigenschaften auf makroskopischer Ebene reduziert. Der Nachweis einzelner Zellen scheint unrealistisch; klinische MRT wird darauf beschränkt sein, Ansammlungen von Zellen nachzuweisen.

Magnetically labeled cells (MLC) cause local field inhomogenities within the single voxels as well as on a macroscopic scale. The related Larmor frequency shift near MLC was exploited to obtain bright visualization applying spectral selective saturation (SSS). SK-Mel28 cells were labeled with the superparamagnetic iron oxide contrast agent SHU 555A. Low cell concentrations (0, 5, 20, 30, 50, 75, and 150 MLC/microl) and high cell concentrations (10 x 10(3), 30 x 10(3), 60 x 10(3), and 100 x 10(3) MLC/10 microl) were examined at 3 Tesla. Shimming and frequency adjustment to spectrometer reference frequency v0 was performed with the built in routine of the scanner. A 2D spin echo sequence with broadband excitation and refocusing pulses was used (BWex = 1.000 Hz). Prior to each TR, a non-selective saturation sinc pulse centred at v0 was applied. Bandwidth (BWsat) of this pulse was varied from 100 Hz to 800 Hz in logarithmic steps. Without SSS the highest value of Crel (i.e. relative MR contrast between labeled to unlabeled samples) was found for 150 MLC/microl and was given by 10%. Applying SSS led to positive contrast of the complete labeled volumes and to remarkable improvements in Crel. With increasing cell concentrations Crel raised to maximum, that was given by 52% (BWsat=100 Hz) and 28% (BWsat = 200 Hz) found for 75 MLC/microl. For 150 MLC/microl Crel decreased. A contrast clarification could also be detected near cell aggregations despite saturation. Using SSS positive contrast can be achieved for voxels containing MLC and voxels close to cell clusters. Under in vitro conditions positive contrast improved the sensitivity to detect MLC as compared to negative contrast imaging techniques. It seems reasonable, that positive contrast approaches can be applied in vivo as the underlying physical mechanism are comparable.

PURPOSE. This work aims to present a preparation technique for ex-vivo MR examination of SPIO (superparamagnetic iron oxide) containing solutions or SPIO labeled cells. Accumulations of SPIO particles and labeled cells were prepared in different concentrations using agar gel phantoms. Signal extinction around accumulations of magnetic material was examined systematically by gradient echo sequences with variable echo times and spatial resolution. The correlation between local iron concentration and diameter of signal extinction in MR gradient echo images was investigated. Resovist, (SHU 555A) was used as superparamagnetic contrast medium. Different concentrations of SPIO-containing solutions (0.75 - 15 mg Fe/10 ml) and magnetically labeled SK-Mel28 cells (25,000-1,000,000 cells/10 ml) were accommodated inside a defined volume in an agar matrix. Diameters of signal void were assessed in dependence on local iron concentration, echo time (5-25 ms) and isotropic spatial resolution (length of voxel 0.25 - 0.60 mm). Measurements were performed on a clinical MR whole body scanner (3 Tesla) using a spoiled gradient echo sequence (FLASH). For the present experimental conditions sensitivity to detect the magnetic label was maximized using TE 25 ms. In contrast, the area of signal cancellation was minimized using TE 5 ms and isotropic resolution of 0.25 mm. In the latter case the image indicated the area of magnetic material most precisely. Diameter of signal cancellation was a logarithmic function on local iron concentration. In the presented set-up detection of concentrations as low as 0.75 mg Fe/10 ml in SPIO-containing solution or 1.25 mg Fe/10 ml in SPIO-labeled SK-Mel28 cells was certainly possible. The proposed preparation strategy with a well defined spatial distribution of the magnetic material in an agar gel phantom produced reliable results and appears clearly superior compared to set-ups with randomly distributed material in glass tubes. The diameter of the signal extinction in gradient echo images was significantly affected by the choice of echo time and spatial resolution. The calibration of signal cancellation versus iron concentrations may be valuable to assess SPIO concentrations and possibly numbers of labeled cells under specific conditions in vitro or even in vivo.