Koji Kadota

データの可視化や表現手段は多様である。データ解析環境Rではggplot2というパッケージが、そしてPythonではseabornやplotnineというライブラリがよく用いられる。サンキー図（Sankey diagram）は、クロス集計表で示すような情報を可視化する手段の1つである。この種の可視化手段としてはモザイク図やツリーマップなどが挙げられるが、積み上げ棒グラフにベン図の長所をうまく組み合わせたような特徴をもつ。沖積図（alluvial graph）やパラレルセットとよばれるものと実質的に同等であり、直感的には比較ゲノムにおけるシンテニー領域を可視化したダイアグラムをイメージすればよい。日本におけるサンキー図の認知度は決して高くはないものの、海外ではアピール力の高い視覚化手段として様々な分野で利用されている。本稿では、ggplot2と組み合わせて用いるggsankeyfierパッケージのインストールからスタートし、サンキー図の特徴について解説する。

今回は、アンプリコン解析プログラムであるdada2実行結果のデータ処理について解説する。解析サンプルは19属・22種から構成される疑似微生物群集であり、この情報を再現可能な3種類のDNA抽出キットと4種類の保存バッファの組合せを調べるのが目的である。データ処理の入力は、dada2実行結果（計580個のASV配列、系統推定結果、配列ごとの出現頻度）と正解情報（解析サンプルの系統リスト）である。主な出力は、それぞれの系統に割り当てられたASV配列の出現頻度、および性能評価指標（感度と適合率）である。本稿では、一連のデータ処理の流れを自作関数の利用例を交えて解説する。また、動作確認の重要性を強調するとともに、自作関数中のバグ発見や生物種名のスペルミス発見に至る過程、そしてそれが与えるインパクトについても述べる。

Rパッケージdada2は、メタゲノムのリードデータを入力として、サンプル中にどのような系統が含まれるかを返すアンプリコン解析プログラムである。本稿では、dada2の関数を用いて、疑似微生物群集のリードデータに対するクオリティコントロールから系統割り当てまでの一連の流れを解説する。Rを用いたデータ解析の実行自体は非常に簡単である。このパッケージに限らず、ユーザは入出力の関係性を正しく理解しながら進めていくことが重要である。今回の内容も、Rの基本的な関数（dim, length, sum, tableなど）の解説を多く含んでいる。これらをうまく組み合わせるだけでも、解析結果を多角的に確認・理解することができる。

アンプリコン解析は、全てのバクテリアゲノム中に存在する16SリボソームRNA（16S rRNA）遺伝子の一部の領域をPCR増幅し、増幅された部分配列（アンプリコン）をシーケンスすることによって、解析サンプル中にどのような菌種がどれだけ存在するかという系統組成を調べるものである。本稿ではまず、PCRに用いるプライマーと情報解析の流れについて述べる。次に、解析データとプログラム（dada2パッケージ）のインストールについて述べる。最後に、入出力ファイルの取扱い時に利用するRの文字列操作について解説する。

メタゲノム解析は，ある環境における微生物群集の塩基配列情報を網羅的に決定して解析する手法のことである。メタゲノム解析には，全てのバクテリアゲノム中に存在する16SリボソームRNA（16S rRNA）の一部の領域に限定してシーケンスを行うアンプリコン解析から，ゲノム中の解析対象範囲を限定しない本当の意味でのメタゲノム解析まで含まれる。それぞれの特徴に応じた長所と短所があり，目的に応じて使い分けられている。その一方で，DNA抽出など情報解析前の実験部分は，いずれの解析においても極めて重要である。本稿では，アグリバイオインフォマティクス教育研究プログラムで実施されているメタゲノム解析に関する講義内容を中心に解説する。

Background RNA-seq is a tool for measuring gene expression and is commonly used to identify differentially expressed genes (DEGs). Gene clustering has been widely used to classify DEGs with similar expression patterns, but rarely used to identify DEGs themselves. We recently reported that the clustering-based method (called MBCdeg) for identifying DEGs has great potential. However, a thorough investigation of its feasibility is still needed. Results We compared a total of six competing methods: three conventional R packages (edgeR, DESeq2, and TCC) and three versions of MBCdeg (denoted as MBCdeg1, 2, and 3) corresponding to three different normalization algorithms. Different scenarios of simulated data generated from three R packages (TCC, compcodeR, and PROPER) were mainly evaluated based on the area under the receiver operating characteristic curve (AUC) as a measure for both sensitivity and specificity. We found that the modified version of MBCdeg2 performed well for many scenarios on simulated data. However, MBCdeg showed very unstable results between trials for identical real data. Conclusions The current MBCdeg2 shows excellent performance in simulation analysis, but not at a practical level for real data. Since further improvements are needed for MBCdeg to reach a practical level, we cannot recommend the use of the current MBCdeg. Our report suggests not only the need for method developers to carefully describe their shortcomings, but also the need for the reader to critically decipher the conclusions reached under what conditions.

シミュレーションデータの生成は、乱数を発生させることと同義である。ただし、何もない状態からRNA-seqカウントデータの性質を模倣したシミュレーションデータを生成することはもちろんできない。本稿ではまず、乳酸菌RNA-seqカウントデータから、シミュレーションデータの生成に必要なパラメータを取得する。次に、それらの情報を経験分布として用いて負の二項分布に従う乱数を発生させ、得られたデータが確かに元のリアルデータと同じ性質をもつことを示す。一連の処理を古典的なBase-Rとモダンなtidyverseの両方の手段で解説する。

RNA-seq 解析の目的の多くは、比較する状態または群間で発現の異なる遺伝子（DEG）の同定である。ほとんどのプログラムは R のパッケージとして提供されており、その入力は、カウントデータとよばれる各行が遺伝子、各列がサンプルからなる数値行列である。本稿では、なぜ負の二項分布とよばれる統計モデルが DEG 検出目的でよく用いられるのかについて、数式を交えて解説する。また、このカウントデータの性質を説明する手段としてよく用いられる平均－分散プロットについて、データの前処理から ggplot2 による描画まで述べる。

マークダウン（Markdown）は、HTML を手軽に生成するために開発された軽量マークアップ言語である。R Markdown は、R のコマンドと Markdown を組み合わせたものであり、近年主流となっている R の実行手段である。多くのユーザにとっては見慣れないファイルの拡張子（.Rmd）かもしれないが、アグリバイオインフォマティクス教育研究プログラムの中でも利用されている。本稿ではまず、R Markdown の基本的な利用法として、チャンクの概念や HTML の生成などを述べる。次に、前回作成した R スクリプトファイルの内容を R Markdown 化し、相違点について述べる。最後に、個々の R コマンドや実行結果として得られるオブジェクトについて解説する。ウェブサイト（R で）塩基配列解析のサブ（URL: http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/kadota/r_seq2.html）中のウェブ資料（以下、W）を併用してほしい。

2020 年より続くコロナ禍の影響により、我々のバイオインフォマティクス（以下、バイオインフォ）教育の枠組みも大きな変革を強いられた。2020 年以降はオンライン講義が当たり前となり、2019 年まで売りにしていた「1人1台のノートPC を用いた講義」という特徴が消滅しただけでなく、多様なPC 環境に起因する様々な困難に直面した。2021 年は、チームコミュニケーションツールである Slack の併用によって「過去になされた質問とその顛末」の共有が可能となり、一定の省力化がなされた。また、コロナ禍とは無関係に、Python プログラミングに特化した講義の実施や、実験技術の進展に合わせた内容の更新にも取り組んでいる。本稿では、アグリバイオインフォマティクス教育研究プログラム（以下、アグリバイオ）のこれまでの取り組み、オンライン講義のメリット、そしてバイオインフォ教育の今後について述べる。