Elena V. Preobrazhenskaya

Next-generation sequencing (NGS) is currently regarded as a preferable method for detection of actionable alterations in non-small cell lung carcinomas (NSCLCs). RNA-based NGS is particularly efficient in detection of gene fusions and allows for mRNA expression analysis of relevant genes. This study describes a novel library preparation pipeline for targeted RNA sequencing, which is based on the 5′ rapid amplification of the cDNA ends (5′ RACE) and anchored multiplex PCR. The NGS panel was designed for the analysis of 15 genes relevant to NSCLC therapeutic decisions (ALK, BRAF, CD274 (PD-L1), EGFR, ERBB2 (HER2), KRAS, MET, NRAS, NRG1-2, NTRK1-3, RET and ROS1). The validation against PCR was performed for 168 NSCLC samples. The NGS assay successfully detected all 85 mutations previously identified by PCR. It also confirmed the absence of tested mutations in 82 out of 83 PCR-negative samples. The only discordant case was subsequently analyzed by digital droplet PCR and demonstrated low fraction of the mutated allele. The newly designed NGS panel was subsequently used for the analysis of 272 carcinomas from young (≤50 years old) patients with no driver mutations identified by PCR tests or with failed PCR analysis. NGS was successful in 240 (88.2%) cases, including 35 (64.8%) PCR-failed samples. Driver mutations were detected in 55 tumors, including three previously unreported fusions (PAPLN::ALK, CD55::ROS1 and FKBP15::RET). We conclude that 5′ RACE-based RNA sequencing is a viable approach for NSCLC molecular testing.

Введение. Более 10 % случаев рака молочной железы (РМЖ) приходится на наследственные и семейные случаи заболевания. Основой стандартного генетического анализа наследственного характера РМЖ являются хорошо изученные гены BRCA1 и BRCA2. Между тем, значительная доля случаев РМЖ детерминирована мутациями в других генах. Кроме того, рутинная клиническая молекулярная диагностика, как правило, ограничивается анализом микромутаций, не идентифицируя крупные структурные перестройки с изменением копийности локусов (CNV, copy number variation). При этом до 10 % наследственных дефектов в генах BRCA1/2 и их партнеров относятся к этому типу альтераций. Цель. Анализ частоты и спектра патогенных вариантов, включая крупные генные перестройки, на расширенной панели генов у больных РМЖ. Материалы и методы. При помощи таргетного секвенирования нового поколения кодирующая последовательность генов ATM, BARD1, BLM, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, FANCD2, NBN, PALB2, RAD51A, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD54L, TP53 была проанализирована у 7 840 больных РМЖ. Биоинформатический анализ включал детекцию однонуклеотидных замен и микроделеций/инсерций, а также анализ копийности экзонов. Обнаруженные нарушения копийности локусов были верифицированы с помощью цифровой капельной ПЦР. Результаты. Наследственная причина РМЖ была обнаружена у 16,4 % (n = 1 291) больных. В 43 случаях было зарегистрировано сочетание двух патогенных вариантов. Встречаемость патогенных вариантов коррелировала с семейным анамнезом и первично-множественным характером заболевания. Корреляция с молодым возрастом пациентов зарегистрирована только для мутаций в генах BRCA1/2. В спектре микромутаций преобладали нарушения в генах BRCA1 (26,9 %), BRCA2 (26 %) и CHEK2 (13,5 %). Более четверти обнаруженных микромутаций были уникальными, а 41 % представляли частые повторяющиеся варианты. Крупные структурные перестройки составили 9,2 % всех найденных мутаций. Чаще всего CNV обнаруживались в генах CHEK2 и BRCA1: доля мутаций в этих генах, приходящаяся на CNV, составила 35,4 % и 7,1 % соответственно. Нарушения копийности экзонов также были обнаружены в генах ATM, BLM, BRCA2, PALB2 и RAD51C. Выводы. Расширение панели исследуемых генов и внедрение CNV-анализа, наряду с поиском микромутаций, позволит улучшить стратификацию пациентов с наследственным РМЖ и оптимизировать выбор терапевтических стратегий.

Введение. Микросателлитная нестабильность (Microsatellite Instability, MSI) является признаком дефицита системы репарации неспаренных оснований ДНК. Идентификация MSI в опухоли имеет значение для выбора лечебной тактики, так как MSI-позитивные новообразования отличаются высокой чувствительностью к терапии ингибиторами контрольных точек иммунного ответа. Кроме этого, часть опухолей с MSI развивается в контексте наследственного заболевания — синдрома Линча. Цель. Анализ встречаемости и причин возникновения MSI в злокачественных новообразованиях предстательной железы у российских пациентов. Материалы и методы. Исследуемую группу составил 1201 случай рака предстательной железы (РПЖ). Для определения статуса MSI использовалась ПЦР-панель из 10 микросателлитных маркеров. В 10 из 13 MSI-позитивных РПЖ при помощи таргетного секвенирования нового поколения был выполнен анализ последовательности генов MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2. Результаты. MSI была обнаружена в 13 из 1136 (1,1 %) проанализированных образцов РПЖ. Большинство опухолей с MSI имели признаки агрессивного заболевания: 90 % MSI-позитивных РПЖ были диагностированы на 3–4-й стадии, и 75 % отличались низкой дифференцировкой. Мутации в генах MSH2 и MSH6, предположительно ставшие причиной MSI, были обнаружены в 5/10 (50 %) просеквенированных случаев. В одном из этих случаев была подтверждена наследственная природа патогенного варианта, подразумевающая диагноз синдрома Линча, и еще у трех пациентов в опухоли были обнаружены описанные при этом заболевании мутации. Их происхождение не удалось определить в связи с отсутствием образцов неопухолевой ДНК. Выводы. Встречаемость MSI при опухолях предстательной железы составляет около 1 %. От 10 до 40 % MSI-позитивных РПЖ могут возникать как проявление синдрома Линча.

Введение. Мутации в гене KRAS выявляются примерно в 15–30 % случаев аденокарцином легкого, однако до сих пор разработать таргетное лечение этой крупной категории рака легкого не удавалось (за исключением новообразований с мутацией p.G12C). Перспективным направлением терапии данной категории опухолей предполагается ингибирование киназы MEK, ключевого участника сигнального каскада, индуцируемого белками семейства RAS. Тем не менее, применение ингибиторов MEK в монорежиме не приводит к терапевтическому эффекту, так как клетки адаптируются к данному воздействию посредством запуска механизма аутофагии. Цель. Исследовать эффективность комбинации ингибитора MEK траметиниба и ингибитора аутофагии гидроксихлорохина для терапии немелкоклеточного рака легкого с мутациями в гене KRAS с использованием модели тканевых эксплантов. Материалы и методы. В исследование был включен материал 38 первичных хемонаивных карцином легкого. Полученные из операционного материала тканевые экспланты опухолей инкубировались на протяжении 48 ч в питательной среде с добавлением траметиниба и/или гидроксихлорохина в различных концентрациях. Эффективность лекарственного воздействия оценивалась посредством иммуногистохимического анализа уровня фосфорилирования ERK (отражает активность MEK-киназы) и каспазы-3 (маркер апоптоза). По результатам морфологической оценки жизнеспособности и качества опухолевых эксплантов, в итоговый анализ чувствительности к препаратам был включен 21 образец, шесть из которых имели мутации в гене KRAS. Результаты. Снижение уровня p-ERK наблюдалось во всей выборке при воздействии комбинации траметиниба и гидроксихлорохина в концентрациях 20 и 25 мкМ соответственно (p = 0,005). Эффект был в большей степени выражен в эксплантах с мутациями KRAS (p = 0,006), чем в опухолях без мутаций или с другими генетическими драйверными событиями. Значимые изменения экспрессии маркера апоптоза c-Casp3 не были обнаружены. Выводы. Комбинированное воздействие траметиниба и гидроксихлорохина приводит к снижению активности киназы MEK в клетках опухолей легкого с мутациями в гене KRAS.

Aim: This study aimed at the identification of new druggable alterations in non-small cell lung carcinomas (NSCLCs). Methods: RNA next generation sequencing (NGS) analysis for 650 protein kinase genes was performed for 89 NSCLCs obtained from young-onset and/or female non-smokers, who were negative for activating events involving EGFR, ALK, ROS1, RET, MET, NTRK1/2/3, BRAF, HER2, KRAS, or NRAS genes. Results: RNA sequencing identified 32 in-frame rearrangements, including 9 instances of fully preserved and 8 tumors with partially preserved tyrosine kinase domains. These 17 translocations were further analyzed in 1,059 mutation-negative NSCLCs, which resulted in the identification of two additional tumors with ADK::KAT6B rearrangement and one carcinoma carrying RPS6KB1::VMP1 fusion. The recently reported CLIP1::LTK gene fusion was tested in 2,754 NSCLCs, which were negative for all known actionable mutations, however, no new instances of this translocation have been observed. We further analyzed RNA sequencing results of 89 NSCLCs for mutations affecting the kinase domain of the involved gene. There were 53 substitutions with a combined annotation dependent depletion (CADD) score above 25; all these lesions turned out to be unique, as the analysis of 551 additional NSCLCs revealed no recurrent alterations. ROS1, LTK, and FGFR4 high-level overexpression was observed in 1 out of 89 tumors each. Conclusions: This study demonstrates the scarcity of yet unknown kinase-activating alterations in NSCLCs.

Введение. Микросателлитная нестабильность (MSI) является следствием дефекта системы репарации неспаренных оснований ДНК и сопровождается накоплением множества мутаций в ткани опухоли. Этот феномен характерен для колоректальных опухолей, карцином желудка, рака эндометрия и некоторых других типов новообразований. MSI в опухолях часто сочетается с активацией сигнального пути MAPK, в частности с мутациями в генах KRAS, NRAS и BRAF. Недавние исследования показали, что в опухолях с микросателлитной нестабильностью также могут встречаться транслокации с участием тирозинкиназ ALK, ROS1, RET и NTRK1-3. Цель. Изучить частоту и спектр активирующих транслокаций тирозинкиназ при опухолях разных локализаций с микросателлитной нестабильностью. Материалы и методы. Статус MSI был определен для 27 408 новообразований. Выявление перестроек с участием генов ALK, ROS1, RET и NTRK1-3 в 1284 образцах MSI-позитивных опухолей осуществлялось при помощи тестов по определению несбалансированной экспрессии 5’/3’-концов гена, вариант-специфической ПЦР и высокопроизводительного секвенирования РНК (РНК-NGS). Результаты. Перестройки были обнаружены в 101/990 (10,2 %) случае колоректального рака и 1/108 (1 %) опухоли желудка (ALK: 11; RET: 25; NTRK1: 42; NTRK2: 2; NTRK3: 22), и не были выявлены при раке эндометрия (n = 157), шейки матки (n = 13), поджелудочной железы (n = 7), холангиокарциноме (n = 4) или раке яичника (n = 5). Самой высокой частота транслокаций оказалась среди KRAS/NRAS/BRAF-негативных колоректальных карцином с MSI 93/395 (23,5 %). Гораздо реже перестройки обнаруживались при раке толстой кишки с мутациями KRAS/NRAS/BRAF (8/597, 1,3 %). При раке толстой кишки присутствие транслокаций ассоциировалось с возрастом старше 50 лет ((97/795 (12,2 %) vs 3/195 (1,5 %), p = 0,0002)). Выводы. Транслокации с участием генов тирозинкиназ встречаются со значительной частотой при MSI-позитивном раке толстой кишки, в особенности при KRAS/NRAS/BRAF-негативных опухолях.

Although immune checkpoint inhibitors (ICIs) are widely used in clinical oncology, less than half of treated cancer patients derive benefit from this therapy. Both tumor- and host-related variables are implicated in response to ICIs. The predictive value of PD-L1 expression is confined only to several cancer types, so this molecule is not an agnostic biomarker. Highly elevated tumor mutation burden (TMB) caused either by excessive carcinogenic exposure or by a deficiency in DNA repair is a reliable indicator for ICI efficacy, as exemplified by tumors with high-level microsatellite instability (MSI-H). Other potentially relevant tumor-related characteristics include gene expression signatures, pattern of tumor infiltration by immune cells, and, perhaps, some immune-response modifying somatic mutations. Host-related factors have not yet been comprehensively considered in relevant clinical trials. Microbiome composition, markers of systemic inflammation [e.g., neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR)], and human leucocyte antigen (HLA) diversity may influence the efficacy of ICIs. Studies on ICI biomarkers are likely to reveal modifiable tumor or host characteristics, which can be utilized to direct the antitumor immune defense. Examples of the latter approach include tumor priming to immune therapy by cytotoxic drugs and elevation of ICI efficacy by microbiome modification.

The management of lung cancer (LC) requires the analysis of a diverse spectrum of molecular targets, including kinase activating mutations in EGFR, ERBB2 (HER2), BRAF and MET oncogenes, KRAS G12C substitutions, and ALK, ROS1, RET and NTRK1-3 gene fusions. Administration of immune checkpoint inhibitors (ICIs) is based on the immunohistochemical (IHC) analysis of PD-L1 expression and determination of tumor mutation burden (TMB). Clinical characteristics of the patients, particularly age, gender and smoking history, significantly influence the probability of finding the above targets: for example, LC in young patients is characterized by high frequency of kinase gene rearrangements, while heavy smokers often have KRAS G12C mutations and/or high TMB. Proper selection of first-line therapy influences overall treatment outcomes, therefore, the majority of these tests need to be completed within no more than 10 working days. Activating events in MAPK signaling pathway are mutually exclusive, hence, fast single-gene testing remains an option for some laboratories. RNA next-generation sequencing (NGS) is capable of detecting the entire repertoire of druggable gene alterations, therefore it is gradually becoming a dominating technology in LC molecular diagnosis.

Introduction. Long-term outcomes of metastatic urothelial cancer remain unsatisfactory: the 5-year survival rate for this disease is less than 15 %. It is important to develop and introduce into clinical practice new drugs, including targeted agents, and the individualization of systemic therapy for urothelial cancer based on molecular genetic analysis of tumor tissue. Erdafitinib, a new drug developed for the treatment of locally advanced and metastatic urothelial cancer with certain genetic alterations in the FGFR2 and FGFR3 receptors, was registered in Russia in 2023. Materials and Methods. This work investigated the distribution of clinically relevant mutations/translocations affecting the FGFR2/3 genes in a large number urothelial cancer patients in Russia using a new test system developed on the basis of highly sensitive methods, such as digital droplet PCR and real-time PCR. Results and Conclusion. 34 out of 182 patients (18.7 %) presented genetic aberrations. These aberrations included mutations R248C (n = 4), S249C (n = 16), G370C (n = 4) and Y373C (n = 8) in the FGFR3 gene, and translocation FGFR3-TACC3 (F17;T11) (n = 2). FGFR3 gene alterations were more frequent in upper urinary tract tumors: mutations/translocations were found in 5/8 (62.5 %) renal pelvic cancer patients, in 2/6 (33.3 %) ureteral cancer patients and in 21/120 (17.5 %) bladder cancer patients (p = 0,008). There was also an association with patient age and a tendency for more frequent detection of mutations in the localized form of the disease (stages 1-2). Conclusion. The developed methods of mutation and translocation testing can be further used in clinical practice to determine the sensitivity of tumours to erdafitinib treatment. Введение. Долговременные результаты лечения метастатического уротелиального рака остаются неудовлетворительными: 5-летняя выживаемость при этом заболевании составляет менее 15 %. Разработка и внедрение в клиническую практику новых, в том числе таргетных препаратов, а также индивидуализация системной терапии уротелиального рака на основе молекулярно-генетического анализа опухолевой ткани являются актуальными задачами. Эрдафитиниб — новый препарат для лечения местнораспространённого и метастатического уротелиального рака с определёнными генетическими изменениями в рецепторах FGFR2 и FGFR3, был зарегистрирован в России в 2023 г. Материалы и методы. В настоящей работе нами было изучено распределение клинически значимых мутаций/транслокаций генов FGFR2/3 на значительной по объёму выборке российских пациентов с уротелиальным раком при помощи собственной тест-системы, разработанной на основе высокочувствительных методов — цифровой капельной ПЦР и ПЦР в реальном времени. Результаты. Генетические нарушения были обнаружены у 34 из 182 (18,7 %) пациентов. Были выявлены следующие аберрации: мутации в гене FGFR3 R248C (n = 4), S249C (n = 16), G370C (n = 4) и Y373C (n = 8), а также транслокации FGFR3-TACC3 (F17;T11) (n = 2). Данные изменения чаще выявлялись в опухолях верхних мочевых путей: мутации/транслокации были найдены у 5/8 (62,5 %) пациентов с раком почечной лоханки, у 2/6 (33,3 %) пациентов с раком мочеточника и у 21/120 (17,5 %) пациентов с раком мочевого пузыря (p = 0,008). Также наблюдалась ассоциация с возрастом пациентов и тенденция к более частому обнаружению мутаций при локализованной форме заболевания (стадии 1-2). Выводы. Разработанные методы тестирования мутаций и транслокаций в дальнейшем могут быть использованы в клинической практике для определения чувствительности опухолей к лечению эрдафитинибом.

The majority of NTRK1, NTRK2, and NTRK3 rearrangements result in increased expression of the kinase portion of the involved gene due to its fusion to an actively transcribed gene partner. Consequently, the analysis of 5′/3′-end expression imbalances is potentially capable of detecting the entire spectrum of NTRK gene fusions. Archival tumor specimens obtained from 8075 patients were subjected to manual dissection of tumor cells, DNA/RNA isolation, and cDNA synthesis. The 5′/3′-end expression imbalances in NTRK genes were analyzed by real-time PCR. Further identification of gene rearrangements was performed by variant-specific PCR for 44 common NTRK fusions, and, whenever necessary, by RNA-based next-generation sequencing (NGS). cDNA of sufficient quality was obtained in 7424/8075 (91.9%) tumors. NTRK rearrangements were detected in 7/6436 (0.1%) lung carcinomas, 11/137 (8.0%) pediatric tumors, and 13/851 (1.5%) adult non-lung malignancies. The highest incidence of NTRK translocations was observed in pediatric sarcomas (7/39, 17.9%). Increased frequency of NTRK fusions was seen in microsatellite-unstable colorectal tumors (6/48, 12.5%), salivary gland carcinomas (5/93, 5.4%), and sarcomas (7/143, 4.9%). None of the 1293 lung carcinomas with driver alterations in EGFR/ALK/ROS1/RET/MET oncogenes had NTRK 5′/3′-end expression imbalances. Variant-specific PCR was performed for 744 tumors with a normal 5′/3′-end expression ratio: there were no rearrangements in 172 EGFR/ALK/ROS1/RET/MET-negative lung cancers and 125 pediatric tumors, while NTRK3 fusions were detected in 2/447 (0.5%) non-lung adult malignancies. In conclusion, this study describes a diagnostic pipeline that can be used as a cost-efficient alternative to conventional methods of NTRK1–3 analysis.