Mathieu Decloquement

Bases moléculaires et évolutives de la biosynthèse de la polysialylation : étude des spécificités enzymatiques des polysialyltransférases de poissons: Contrairement aux humains qui ne génèrent qu'un seul type de polymère constitué d'acides N-acétylneuraminiques liés en α2,8, les poissons sont capables de générer une large gamme d'acides polysialiques variant selon l'ordre des téléostéens (Salmoniformes, Cypriniformes, …). Alors que deux poly-α-2,8-sialyltransférases humaines ST8Sia II et ST8Sia IV sont responsables de la synthèse de polyNeu5Ac sur un nombre limité de glycoprotéines, la machinerie de biosynthèse des poissons conduisant à la biodiversité de polySia n'est actuellement pas connue. En effet, des études phylogénétiques des ST8Sia ont révélé une distribution particulière des gènes de polyST de poisson par rapport à ceux humains. Trois gènes de polyST st8sia4, st8sia2-r1 et st8sia2-r2 ont été identifiés dans le génome des salmonidés et pourraient être impliqués dans la biosynthèse de ces polySia.Au cours de mon doctorat, j'ai conçu des polyST solubles et étiquetées du salmonidé Coregonus maraena par clonage moléculaire et j'ai produit ces enzymes recombinantes dans le milieu de culture de cellules de mammifères transitoirement transfectées. En parallèle, j'ai synthétisé chimio-enzymatiquement du CMP-Neu5Ac, CMP-Neu5Gc et CMP-Kdn, à partir des trois principaux acides sialiques rapportés chez les vertébrés (i.e. Neu5Ac, Neu5Gc et Kdn), pour les utiliser comme substrats donneurs naturels dans les réactions de sialylation. J'ai également préparé divers substrats accepteurs ainsi qu'un donneur d'acide sialique fonctionnalisé avec un alcyne (i.e. CMP-SiaNAl) pour des approches bioorthogonales de chimie-clic. En utilisant ces outils de biosynthèse spécifiques et le test MPSA récemment développé, j'ai optimisé les conditions des essais de polysialylation (température, pH, durée) et comparé les activités des enzymes de poisson et humaines. J'ai notamment réalisé la caractérisation biochimique de ST8Sia IV de poisson en MPSA, démontré son activité préférentielle sur des substrats accepteurs connus pour les polySTs humaines (NRP-2 et DNAse I) et sur d'autres accepteurs (PSGP, orosomucoïde, BSM et ALCAM). Notamment en utilisant l'ALCAM en MPSA, j'ai déterminé les paramètres cinétiques des ST8Sia IV humaine et de corégone et montré leurs différences d'affinités envers le CMP-SiaNAl.Ensuite, j'ai effectué des réactions de polysialylation avec du CMP-Neu5Ac, CMP-Neu5Gc et CMP-Kdn dans des essais in vitro et cellulaires suivis d'analyses structurales de produits polysialylés en utilisant l'anticorps monoclonal anti-polySia 735 et l'endoneuraminidase-N. J'ai pu démontrer des spécificités de substrat uniques de l'enzyme de poisson par rapport à son homologue humaine. J'ai montré que C.maraena ST8Sia IV présente un intérêt particulier pour modifier les glycoprotéines avec des différences notables dans la reconnaissance des substrats pour générer des polymères in vitro et de surface cellulaire composés de Neu5Ac, Neu5Gc et Kdn.Afin de comprendre comment cette voie de polysialylation est régulée chez les vertébrés, l'influence de l'autopolysialylation a été étudiée. Comme rapporté pour les polyST de mammifères, j'ai également montré que l'autopolysialylation est possible pour ST8Sia IV de poisson mais n'est pas essentielle à son activité catalytique.Enfin, la modélisation de structure 3D de polyST a été initiée à l'aide d'AlphaFold et a révélé des boucles désordonnées et changements d'acides aminés dans les sialylmotifs conservés et les motifs PBR et PSTD. Ces differences de structure entre polyST humaines et de poisson pourraient être impliquées dans des interactions dimériques potentielles, une flexibilité du domaine catalytique et pourraient expliquer les spécificités enzymatiques des polyST de poisson.Ces études ont mis en lumière la structure-fonction des polyST de vertébrés et ouvrent la voie à la synthèse de matériaux innovants polysialylés qui seront combinés à des biomolécules antimicrobiennes pour le développement de nouvelles surfaces bioactives à l'avenir.

Human sialyltransferases primarily utilize CMP‐Sias, especially transferring Neu5Ac from CMP‐Neu5Ac to various acceptors. Advances in chemical biology have led to the synthesis of novel CMP‐Sia donors suitable for bioorthogonal reactions in cell‐based assays. However, the compatibility of these donors with all human enzymes remains uncertain. We synthesized a non‐natural CMP‐Sia donor with an alkyne modification on the N ‐acyl group of Neu5Ac, which was effectively used by human ST6Gal I and ST3Gal I. A sensitive MicroPlate Sialyltransferase Assay (MPSA) was developed and expanded to a panel of 13 human STs acting on glycoproteins. All assayed enzymes tolerated CMP‐SiaNAl, allowing for the determination of kinetic parameters and turnover numbers. This study enhances the biochemical characterization of human sialyltransferases and opens new avenues for developing sialyltransferase inhibitors.

The Sd^a carbohydrate epitope and its biosynthetic B4GALNT2 enzyme are expressed in the healthy colon and down-regulated to variable extents in colon cancer. The human B4GALNT2 gene drives the expression of a long and a short protein isoform (LF-B4GALNT2 and SF-B4GALNT2) sharing identical transmembrane and luminal domains. Both isoforms are trans-Golgi proteins and the LF-B4GALNT2 also localizes to post-Golgi vesicles thanks to its extended cytoplasmic tail. Control mechanisms underpinning Sd^a and B4GALNT2 expression in the gastrointestinal tract are complex and not fully understood. This study reveals the existence of two unusual N-glycosylation sites in B4GALNT2 luminal domain. The first atypical N-X-C site is evolutionarily conserved and occupied by a complex-type N-glycan. We explored the influence of this N-glycan using site-directed mutagenesis and showed that each mutant had a slightly decreased expression level, impaired stability, and reduced enzyme activity. Furthermore, we observed that the mutant SF-B4GALNT2 was partially mislocalized in the endoplasmic reticulum, whereas the mutant LF-B4GALNT2 was still localized in the Golgi and post-Golgi vesicles. Lastly, we showed that the formation of homodimers was drastically impaired in the two mutated isoforms. An AlphaFold2 model of the LF-B4GALNT2 dimer with an N-glycan on each monomer corroborated these findings and suggested that N-glycosylation of each B4GALNT2 isoform controlled their biological activity.

We identified and analyzed α2,8-sialyltransferases sequences among 71 ray-finned fish species to provide the first comprehensive view of the Teleost ST8Sia repertoire. This repertoire expanded over the course of Vertebrate evolution and was primarily shaped by the whole genome events R1 and R2, but not by the Teleost-specific R3. We showed that duplicated st8sia genes like st8sia7, st8sia8, and st8sia9 have disappeared from Tetrapods, whereas their orthologues were maintained in Teleosts. Furthermore, several fish species specific genome duplications account for the presence of multiple poly-α2,8-sialyltransferases in the Salmonidae (ST8Sia II-r1 and ST8Sia II-r2) and in Cyprinus carpio (ST8Sia IV-r1 and ST8Sia IV-r2). Paralogy and synteny analyses provided more relevant and solid information that enabled us to reconstruct the evolutionary history of st8sia genes in fish genomes. Our data also indicated that, while the mammalian ST8Sia family is comprised of six subfamilies forming di-, oligo-, or polymers of α2,8-linked sialic acids, the fish ST8Sia family, amounting to a total of 10 genes in fish, appears to be much more diverse and shows a patchy distribution among fish species. A focus on Salmonidae showed that (i) the two copies of st8sia2 genes have overall contrasted tissue-specific expressions, with noticeable changes when compared with human co-orthologue, and that (ii) st8sia4 is weakly expressed. Multiple sequence alignments enabled us to detect changes in the conserved polysialyltransferase domain (PSTD) of the fish sequences that could account for variable enzymatic activities. These data provide the bases for further functional studies using recombinant enzymes.

The mammalian mono-α2,8-sialyltransferase ST8Sia VI has been shown to catalyze the transfer of a unique sialic acid residues onto core 1 O-glycans leading to the formation of di-sialylated O-glycosylproteins and to a lesser extent to diSia motifs onto glycolipids like GD1a. Previous studies also reported the identification of an orthologue of the ST8SIA6 gene in the zebrafish genome. Trying to get insights into the biosynthesis and function of the oligo-sialylated glycoproteins during zebrafish development, we cloned and studied this fish α2,8-sialyltransferase homologue. In situ hybridization experiments demonstrate that expression of this gene is always detectable during zebrafish development both in the central nervous system and in non-neuronal tissues. Intriguingly, using biochemical approaches and the newly developed in vitro MicroPlate Sialyltransferase Assay (MPSA), we found that the zebrafish recombinant enzyme does not synthetize diSia motifs on glycoproteins or glycolipids as the human homologue does. Using comparative genomics and molecular phylogeny approaches, we show in this work that the human ST8Sia VI orthologue has disappeared in the ray-finned fish and that the homologue described in fish correspond to a new subfamily of α2,8-sialyltransferase named ST8Sia VIII that was not maintained in Chondrichtyes and Sarcopterygii.