Miriam Riquelme-Perez

Astrocytes are key partners for neurons and can impact diseases such as Alzheimer’s disease (AD), as they exhibit multiple reactive changes. Recent single cell/nucleus genomics analyses evidence astrocyte subpopulations coexisting in normal and AD brains. However, the signaling cascades controlling them, their functional characteristics and roles in AD are still unknown. Here, thanks to astrocyte-specific reporters for STAT3 and NF-kB signaling pathways, two regulators of astrocyte reactivity, we report the presence of three astrocyte subpopulations defined by their signaling activity, in the prefrontal cortex of male APP/PS1dE9 mice. These subpopulations are not triggered by amyloid deposition and are also observed in wild-type mice. They show distinct morphologies, molecular signatures and functional profiles. While NF-kB+ astrocytes have larger territories and higher lysosomal activity, STAT3+ astrocytes display enhanced hemichannel activity. Specific inhibition of these subpopulations reduces amyloid plaque size and impacts anxiety, social preference and social memory in AD but not wild-type mice. Our results show how innate signaling shapes astrocyte subpopulations in the mouse cortex, with distinct functions in health and disease.

Étude de la signature moléculaire des astrocytes réactifs induits par la voie JAK2-STAT3 à partir de différentes omiques : transcriptomique et protéomique: Les astrocytes sont des partenaires essentiels des neurones dans le cerveau. Ils présentent des changements morphologiques, moléculaires et fonctionnels complexes en conditions pathologiques qui restent à caractériser, tout comme leurs régulateurs. La voie de signalisation Janus kinase (JAK)2-signal transducer and activator of transcription (STAT)3 contrôle la réactivité des astrocytes, notamment dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Huntington (MH), qui est caractérisée par une neurodégénérescence du striatum et l'agrégation de la Huntingtine mutante. Notre objectif est de définir les changements moléculaires régulés par JAK2-STAT3 dans les astrocytes striataux de souris et de mieux comprendre leur rôle dans la MH.Des vecteurs viraux codant pour une forme constitutivement active de JAK2 (JAK2ca) ont été développés pour activer cette voie dans les astrocytes de souris sauvages (WT) et dans un modèle murin de la MH. L'analyse histologique montre que JAK2ca induit des changements morphologiques et une surexpression des marqueurs classiques de réactivité. Une accumulation nucléaire de STAT3 est aussi observée dans le striatum de patients MH, ce qui confirme l'activation de cette voie dans les astrocytes MH.Nous avons d'abord réalisé une analyse sur puce à ADN sur des astrocytes striataux WT. JAK2ca induit des changements transcriptionnels importants dans les astrocytes, et induisant l'expression de gènes liés à l'inflammation, la signalisation des cytokines, la protéostase, le lysosome, le transport vésiculaire et le métabolisme énergétique. Pour évaluer si cette régulation transcriptionnelle se produit également dans le contexte de MH, nous avons effectué un séquençage ARN sur des astrocytes striataux de souris MH. Malgré un faible chevauchement des gènes induits par JAK2ca entre les astrocytes WT et MH, il y avait une convergence dans les fonctions associées, liées à la protéostase. Des expériences fonctionnelles complémentaires réalisées par les membres de l'équipe ont démontré que les astrocytes JAK2ca acquièrent des propriétés bénéfiques, aidant les neurones striataux à détoxifier la Huntingtine mutante grâce à leur activité protéolytique accrue et à la libération de chaperones (Abjean et al. 2023, Brain).Enfin, nous avons effectué une analyse protéomique des astrocytes JAK2ca striataux triés chez les souris WT par analyse de spectrométrie de masse. Après comparaison de six outils bioinformatiques, nous avons trouvé 87 protéines avec une abondance significativement différente, et majoritairement régulées à la baisse, entre les astrocytes GFP et JAK2ca. Ces protéines sont impliquées dans l'adhésion cellulaire, le cytosquelette et la phosphorylation oxydative. De nouveau, il y a un faible nombre de gènes/protéines communes régulées par JAK2ca, mais ces gènes/protéines sont impliqués dans des fonctions convergentes (système ubiquitine-protéasome, adhésion cellulaire et métabolisme). Plusieurs protéines induites par JAK2ca sont impliquées dans les jonctions cellulaires comme la protéine desmosomale DSP qui a été validée histologiquement.Ces analyses secondaires ont été réalisées dans DEVEA (Riquelme-Perez et al. 2023, F1000Research), un logiciel Shiny co-développé pour moi pour la visualisation, l'analyse d'expression différentielle et d'enrichissement des données omiques. Cet outil peut traiter des listes de gènes (ou de protéines) associés à des caractéristiques quantitatives, des matrices de comptages ou des objets DESeq complexes. Les analyses d'enrichissement s'appliquent à quatre organismes modèles différents.A partir de ces analyses transcriptomiques et protéomiques, nous avons découvert une signature cohérente dans les astrocytes JAK2ca du striatum qui pourrait sous-tendre les effets bénéfiques de l'activation de JAK2-STAT3 dans la MH. Ensemble, ces résultats contribuent à l'identification d'un état réactif astrocytaire spécifique qui pourrait être observé dans d'autres troubles cérébraux.

Treating radioresistant tumors like glioblastoma multiforme remains a challenge exacerbated by their immunosuppressive nature. Radiotherapy (RT) plays an immunomodulatory role, exerting both immunosuppressive and immunostimulatory effects. The nature of these effects depends on the total dose, dose per fraction, dose delivery method, and treatment length. Hypofractionation is observed to tip the balance toward immune stimulation. However, the use of hypofractionation is restricted in bulky tumors, such as gliomas, because of the high risk of toxicity. Therefore, finding new strategies leading to more favorable immune responses while reducing normal tissue toxicities could improve cancer treatment. In this study, we examine antitumoral immune responses to proton minibeam RT (pMBRT). Its immunomodulatory effects are not fully understood. To explore this, we conducted an in-depth characterization of the immune response to a curative dose of pMBRT in a preclinical orthotopic rat model of glioblastoma. Our findings revealed a close association between pMBRT and the immune response. pMBRT increased lymphocyte density in tumors more effectively than conventional proton therapy. Single-cell transcriptomics identified several immune cell types and unique transcriptional changes in tumor immune cells following pMBRT, including increased antibody production, chemotactic cytokine expression, and IFN responses. These results underscore the critical role of adaptive immunity, specifically T cells, in pMBRT's mechanism. The potential of pMBRT to trigger an antitumor immune response in a single RT session with minimal damage to healthy tissue makes it a promising candidate for future clinical trials and radioimmunotherapy combinations.

Figure S3. A, T2 image of a F98-bearing rat. B, Flow cytometry results in a F98-bearing rat.

Figure S2. A Gating strategy for tumor immune cell analysis by flow cytometry in Fig. 2.

Figure S12. Analysis of cell–cell communication using CellChat.

Figure S7. Results of the 1,000 iterations to downsize to 2,200 cells per cluster and per sample.

Figure S1. Survival curves of RG2- glioma bearing rats: non-irradiated controls (black), rats receiving 30 Gy in Conv-PT (blue) and rats receiving 30 Gy average dose in pMBRT (red). The survival of the irradiated groups is significantly longer than the controls (p < 0.0001, log-rank (Mantel-Cox) test). There is no significant differences in survival between the two irradiated groups.

Figure S4. Representative images from the IF mutliplex

Figure S10. Removal of contaminant in T cell subclustering. A) Reclustering of clusters C13-C17 of Fig. 5. B) Heatmap of top 10 most significantly differentially expressed genes per cluster. C) Expression of macrophage markers in the clusters confirms contamination, cluster 3 will be removed for following analysis