Sarah Rougé

Le globule rouge (GR) humain possède une grande capacité à se déformer, pour s'adapter à divers stress, en particulier un stress mécanique, lors de son passage dans les capillaires et un stress osmotique, pour résister à la tonicité du milieu. Les canaux ioniques mécanosensibles à la membrane du GR constituent des acteurs majeurs de cette régulation par modulation indirecte de son contenu en eau. C'est le cas de Piezo1 et la Pannexine1 (PANX1) : le premier canal, quand il est stimulé, laisse entrer le calcium entrainant une perte d'eau par efflux de potassium via l'activation du canal potassique calcium-dépendant Gardos ; et le second canal, une fois activé, laisse sortir l'Adénosine TriPhosphate (ATP), permettant un gain d'eau par influx de sodium via l'activation du récepteur purinergique ATP-dépendant. Dans les neurones, une régulation des canaux mécanosensibles fait intervenir des protéines de la famille des stomatines. Or, la stomatine érythrocytaire, fortement exprimée dans des microdomaines membranaires riches en cholestérol, est absente des GRs de rares patients atteints de stomatocytose héréditaire à hématies hyperhydratées (OHSt). Bénéficiant de prélèvements sanguins de témoins et de 3 de ces patients, les travaux de cette thèse ont pour objectif l'étude des flux ioniques en présence et en absence de la stomatine, après stimulations de PANX1 et de Piezo1. Une invalidation par CRISPR Cas9 de l'expression de la stomatine à la membrane de cellules de la lignée érythroleucémique K-562 a également permis de confirmer les résultats obtenus sur GRs. Après vérification de la proximité de la stomatine avec la PANX1 et avec Piezo1 par Proximity Ligation Assay (PLA) in situ sur GRs, stromas et cellules K-562, nous avons démontré que 1) l'activation de PANX1 par élévation du potassium extracellulaire induit l'influx de la 5(6)-carboxyfluoresceine augmenté de 34% dans les GRs témoins (stom+) et de seulement 11% dans les GRs OHSt (stom-); dans les cellules K-562 stom+, l'influx de TO-PRO-3 est augmenté de 35.72% et de seulement 18.46% dans les cellules stom-, après stimulation mécanique de PANX1 ; 2) l'activation de Piezo1 avec son agoniste Yoda1 dans les GRs entraine dans les GRs OHSt une diminution de 57.38% de l'influx calcique par rapport aux GRs témoins. Cette diminution de l'activité des canaux ioniques PANX1 et Piezo1 serait donc corrélée à une perte de mécanosensibilité en absence de stomatine, celle-ci entrainant une déstabilisation des radeaux lipidiques et provoquant la perte partielle de rigidité de la membrane.

Dopamine drives the neuronal activity and synaptic plasticity required for various forms of learning. It supports short-term working memory through activation of the D ₁ -like dopamine receptors D ₁ and D ₅ . Here, we found that the L-type Ca ²⁺ channel Ca _V 1.2 was a critical mediator of D _1/5 signaling in hippocampal pyramidal neurons. In cultured mouse hippocampal neurons, a D _1/5 agonist augmented currents through Ca _V 1.2 in the soma and Ca ²⁺ influx in the dendrites. This effect was mediated through the second messenger cAMP and cAMP-dependent protein kinase (PKA), which phosphorylated the Ca _V 1.2 α ₁ subunit at Ser ¹⁹²⁸ . Ca _V 1.2 and D ₅ colocalized, suggesting that this signaling was spatially restricted. In mice, D _1/5 agonism facilitated spatial working memory in wild-type but not litter-matched Ca _V 1.2 α ₁ S1928A knockin animals. These findings identify Ca _V 1.2 as a key D _1/5 signaling effector that supports dopamine-driven executive functions in cognition.

Pannexin 1 (PANX1) was proposed to drive ATP release from red blood cells (RBCs) in response to stress conditions. Stomatin, a membrane protein regulating mechanosensitive channels, has been proposed to modulate PANX1 activity in non-erythroid cells. To determine whether stomatin modulates PANX1 activity in an erythroid context, we have (i) assessed the in situ stomatin-PANX1 interaction in RBCs, (ii) measured PANX1-stimulated activity in RBCs expressing stomatin or from OverHydrated Hereditary Stomatocytosis (OHSt) patients lacking stomatin, and in erythroid K562 cells invalidated for stomatin. Proximity Ligation Assay coupled with flow imaging shows 27.09% and 6.13% positive events in control and OHSt RBCs, respectively. The uptake of dyes 5(6)-Carboxyfluorescein (CF) and TO-PRO-3 was used to evaluate PANX1 activity. RBC permeability for CF is 34% and 11.8% in control and OHSt RBCs, respectively. PANX1 permeability for TO-PRO-3 is 35.72% and 18.42% in K562 stom⁺ and stom⁻ clones, respectively. These results suggest an interaction between PANX1 and stomatin in human RBCs and show a significant defect in PANX1 activity in the absence of stomatin. Based on these results, we propose that stomatin plays a major role in opening the PANX1 pore by being involved in a caspase-independent lifting of autoinhibition.