Rodrigue Marquant

Les Glycosaminoglycanes (GAGs) sont des polysaccharides linéaires, plus ou moins sulfatés, présents à la surface des cellules et dans la matrice extracellulaire. Ils interagissent avec un grand nombre de protéines (cytokines, facteurs de croissance, enzymes ...) et sont impliqués dans divers processus physiologiques et pathologiques. Dans le cadre de mon travail de thèse, nous avons conçu et synthétisé des molécules mimes de GAGs : des peptides anioniques de 12 à 24 acides aminés, portant des motifs répétés de type (EC’AC’)n et présentant les fonctions caractéristiques des GAGs naturels, à savoir les fonctions acides, apportées par l’acide Glutamique, et sulfoniques, obtenues par oxydation des Cystéines. Une première génération de ces sulfopeptides a été étudiée, au Collège de France, comme inhibiteurs de l’interaction d’une protéine à homéodomaine (Otx2) avec le réseau de GAGs présents autour d’un type cellulaire cible de cette protéine. Le peptide comportant six motifs « EC’AC’» a montré une activité in vivo très prometteuse. Une étude structurale par RMN a ensuite été réalisée pour analyser les interactions de ces sulfopeptides avec la protéine Otx2 produite avec un double marquage 13C, 15N. Cette étude a confirmé que l’interaction se faisait au niveau du domaine de liaison aux GAGs de la protéine. Cette interaction affecte aussi l’hélice 3 de l’homéodomaine, à l’origine de l’internalisation d’Otx2 dans les cellules. Enfin nous avons complété cette étude structurale par une approche de type Biacore, pour développer une stratégie d’analyse plus rapide de l’activité de nos analogues et nous permettre de développer une étude structure-activité efficace.

Nuclear Protein 1 (NUPR1) is a ubiquitous protein playing an important role in cancer and acute kidney injury. Its specific targeting by natural or synthetic antibodies like molecularly imprinted polymers (MIPs), is therefore of interest. NUPR1 is an intrinsically disordered protein (IDP), such that it displays a high degree of flexibility and an unstable secondary/tertiary structure, resulting in a continuous fluctuation of its conformation in the free state. These characteristics are not in favor of the creation of homogeneous binding sites during molecular imprinting, so that imprinting using peptide epitopes is investigated. Based on an in silico rational approach, two α‐helices from the model structure of NUPR1, as predicted by AlPhaFold, are selected. Two cysteine residues are added at both ends of the epitopes to form a disulfide bond, which provides high stability to the α‐helix. The template peptides possess the same 3D structure as the epitope fragments in NUPR1. Consequently, they are effective in producing MIP nanogels that cross‐react with high affinity (IC₅₀ 1 nm) only with NUPR1. The work indicates that α‐helices, besides the preferred flexible loops, can be considered as viable template epitopes for MIPs, opening new opportunities for the obtention of selective antipeptide MIP nanogels for IDPs.

Cell-penetrating peptides can internalize ubiquitously in many, if not all, cell types. To explore the specific targeting issue of cell-penetrating peptides (CPPs), we studied glycosaminoglycan (GAG)-binding peptides previously identified in Otx2 and En2 homeoproteins (HPs), alone or extended with the penetratin-like third helix (H3) of En2. HPs are indeed known to internalize in specific cells, thanks to their GAG-targeting sequence (Joliot et al. 2022; Cardon et al. 2023). We quantified the capacity of these peptides to enter into various cell lines known to express different levels and types of heparan sulfates (HS) and chondroitin sulfates (CS) GAGs. We also analyzed by calorimetry (DSC, ITC) and fluorescence spectroscopy, the binary and ternary interactions between heparin (HI), (4S, 6S)CS (CS-E), zwitterionic phosphocholine (PC) model membranes and those peptides. Altogether, our results demonstrate the existence of Ca2+-dependent interactions between CS-E or HI and PC lipid bilayers, the major phospholipid found in animal cell plasma membrane. Importantly, we show that CS-E can act as a Ca2+-dependent bridge with PC membranes that can be exploited by a chimeric CS-E-recognition motif-H3 peptide to bind and cross the membrane lipid bilayer and get access directly to the cytosol of cells. Altogether, this study brings further information uncovering the molecular mechanism of the translocation process of CPPs that implies specific GAGs at the cell-surface. It also shed light on the role of GAGs in the paracrine activity and cell specificity of HPs.