Margaux Petay

An integrated SEM, µFT-IR, AFM-IR, and H&E workflow for histological, morphological, and chemical characterization at the micro- and nanoscale of biomineralized tissue.

O-PTIR imaging is performed at multiple wavenumbers on a human cell. After pre-processing and segmentation, an overlay image is produced, in which different colors indicate the relative contribution of the individual components.

Analyse multimodale et multi-échelle de biomatériaux complexes : optimisation et contraintes des mesures par nanospectroscopie infrarouge: Dans le domaine du biomédical, l'étude des changements physico-chimiques induits par une pathologie au sein des tissus, à l'échelle cellulaire, peut être cruciale pour élucider les mécanismes à l'origine de ce phénomène. Toutefois, seules quelques techniques d'analyse permettent une description chimique à cette échelle. La nanospectroscopie infrarouge, en particulier l'AFM-IR (Microscopie à Force Atomique-Infrarouge) est prometteuse en permettant une description chimique des matériaux à l'échelle nanométrique. Actuellement, l'AFM-IR est souvent utilisée pour l'étude des cellules et micro-organismes, mais très peu pour l'étude des tissus biologiques en raison de la complexité de ces derniers. Pourtant, de nombreuses applications pourraient bénéficier d'une telle description, comme l'étude des phénomènes de minéralisation dans les tissus mammaires. Les microcalcifications mammaires (MCMs) sont des dépôts calciques anormaux (oxalates ou phosphates de calcium) et dont la composition est, dans la littérature, présumée associée à la nature des lésions : cancéreuses ou non. Malgré la multiplication des recherches sur le sujet au cours des dix dernières années, les processus de formation de ces MCMs et leur lien avec les pathologies et notamment les cancers du sein restent mal compris. Dans ce contexte, une description chimique des MCMs à l'échelle nanométrique pourrait fournir un nouvel éclairage et aider à la compréhension de leur genèse. Les biopsies mammaires (typiquement quelques millimètres à quelques centimètres) contiennent généralement plusieurs MCMs avec une forte dispersion en taille, de quelques centaines de nanomètres à un millimètre. Une stratégie de caractérisation multi-échelle est donc nécessaire pour décrire chimiquement l'entièreté de l'échantillon mais également accéder à une description fine des MCMs. Une approche multimodale et multi-échelle a ainsi été mise en place. Celle-ci permet d'étudier les propriétés morphologiques des MCMs en utilisant la microscopie électronique à balayage, ainsi que leurs propriétés chimiques à l'échelle micrométrique et nanométrique grâce à la microscopie et nanospectroscopie IR (e.g., AFM-IR). Bien que l'étude d'objets inorganiques et cristallins au sein d'une matrice organique par AFM-IR soit complexe, en raison des fortes variations locales des propriétés optiques et mécaniques au sein de ces matériaux hybrides, nous avons réussi à caractériser par AFM-IR des dépôts calciques au sein de tissus biologiques. La mise en œuvre d'une telle approche comporte plusieurs défis, tant d'un point de vue méthodologique qu'expérimental, notamment pour la préparation des échantillons, au cours des mesures, du traitement et de la gestion des données générées, ainsi que de leur interprétation. Tous ces aspects seront détaillés et des solutions proposées illustrant ainsi les capacités de l'AFM-IR pour l'étude des biomatériaux complexes.

Understanding the chemical composition of calcifications in biological tissues at the nanoscale is crucial for deciphering their formation processes and possible pathological implications. Atomic Force Microscopy Infrared Spectroscopy (AFM-IR), by allowing IR spectroscopy at the nanoscale, is thus a promising strategy to access such highly spatially resolved chemical information. However, these specimens' inherent morphological and mechanical heterogeneities pose significant challenges for standard resonance-enhanced (RE-AFM-IR) and tapping AFM-IR acquisition modes. This study introduces a dual-mode approach combining tapping and RE-AFM-IR to address these challenges. Tapping AFM-IR is first employed to acquire the topography of the soft and rough surfaces, while RE-AFM-IR provides chemical description at the submicrometric scale through hyperspectral (HS) imaging. This dual-mode methodology is validated on different mineralized biological samples, including breast microcalcifications, revealing the local chemical heterogeneous distribution within the calcium phosphate matrice. Our results outline that dual-mode AFM-IR, coupled with HS imaging, enables robust chemical characterization of highly heterogeneous biomaterials and offers a more comprehensive description compared to conventional AFM-IR single-wavenumber mapping and local spectra.

Despite the incidence of breast cancer among women, mammography and anatomopathology investigations are still the gold standard method for preventive screening and diagnosis. Several criteria are used to diagnose precisely the severity of the pathology like the distribution and shape of breast microcalcifications (BMCs). However, the link between the different chemical phases of BMCs and the cancer stage remains unclear. As BMCs physicochemical speciation has the potential to help clinicians during their diagnosis, this study aims to propose a methodology using advanced spectroscopical analysis techniques to finely characterize BMCs and uncover the relationship between mineralization processes and breast cancer. A state of the art in the domain is first proposed to highlight the role of BMCs and the importance of extensive analytical analysis using electron microscopy and vibrational techniques. Secondly, a detailed methodology for BMCs multiscale analysis is proposed and the relevance of each technique illustrated through the study of a biopsy from a patient suffering of an infiltrating low-grade ductal carcinoma: scanning electron microscopy analysis was used for the morphological description of BMCs, infrared micro and nanospectroscopy techniques for their chemical speciation at the micrometric and sub-micrometric scales.

This contribution aims to define an analysis procedure for abnormal deposits in human tissues starting from in vivo characterization, down to the nanoscale using major instrumentation. Such an integrated approach is based on recent literature, but particularly on our research over the last twenty years on pathological calcifications. To this end, we begin by describing four successive analytical steps, on the injury site or physician’s surgery, at the hospital, at a typical physicochemical laboratory, and finally at a large scale (possibly multinational) facility. For the first step, we present various techniques which can be implemented on portable instruments. For the second step, commercial analytical setups are used. In a physicochemical laboratory, prototype or commercial setups are used and finally on large scale instruments, characterization techniques with better spatial resolution and/or higher sensitivity or techniques specific to synchrotron radiation are employed.

Medical literature indicates clearly that cystinuria and cystinosis, two severe genetic pathologies, are related to the presence of abnormal L-cystine deposits. While L-cystine adopts a hexagonal crystal morphology consistent with its crystallographic structure (hexagonal, P 6 1 22 space group), abnormal deposits related to cystinosis display a rectangular shape. Because this is unexpected from the hexagonal crystallographic structure of L-cystine, we have investigated this inconsistency using SEM (scanning electron microscopy) and IR (infrared) spectroscopy at micrometre and nanometre scales. Our data clearly indicate the presence of both L-cysteine and L-cystine. Considering that L-cysteine crystals display a rectangular shape, and that a transition phase between L-cysteine and L-cystine is well known, we propose the following model for deposit evolution in cystinosis. The initial abnormal deposit consists of L-cysteine, with a rectangular crystal morphology. The micrometre scale rectangular crystallite shape is retained after the phase transition equilibrium between L-cysteine and L-cystine is established, with some crystalline L-cysteine still remaining.