Diana Manapkyzy

A classical experiment proposed in 1958 by Meselson and Stahl confirmed the semi-conservative mechanism of DNA replication in cellular organisms, according to which, after cell division, each daughter cell inherits a chromosome consisting of one parental chain (W or C) and one newly synthesized complementary chain (C' or W'). Since each DNA strand is replicated the same number of times after each cell division, it can be assumed that the W and C chains are equivalent as a result of a combination of cell division and a semi-conservative DNA replication mechanism. However, some non-cellular organisms, including single-stranded DNA and RNA viruses, do not conform to the concept of strand equivalence. A key feature of vertebrate mitochondrial genomes is the notable asymmetry in nucleotide composition between their two chains. This allows them to be separated during ultracentrifugation in an alkaline cesium chloride gradient into a heavy (H) chain that is rich in guanine and thymine, and a light (L) strand enriched in cytosine and adenine nucleotides. Despite extensive research, the exact mechanism of human mitochondrial DNA replication and its possible connection to this asymmetric composition remain unclear. In this paper, we propose a conceptual model for asymmetric inheritance of mitochondrial DNA strands to account for the strand-specific mutation asymmetry characteristic of vertebrate mtDNA.

Caractérisation in vitro de la réparation aberrante et futile de l'ADN initiée par la Thymine-ADN glycosylase humaine: La Thymine-ADN glycosylase humaine (TDG) est connue pour initier l'élimination de la T mis-appariée avec la G dans un contexte CpG dans la voie de réparation par excision de base (BER), prévenant l'effet mutagène de la désamination spontanée de la 5-méthylcytosine (5mC) dans l'ADN. Des études ont montré que TDG joue un rôle clé dans la régulation de la transcription en interagissant avec divers récepteurs nucléaires et facteurs de transcription, soulignant ainsi sa fonction dans la régulation d'expression des gènes, en particulier pendant le développement. De plus, TDG est impliquée dans la régulation épigénétique de transcription en empêchant la méthylation de novo des promoteurs riches en CpG en participant dans la déméthylation active de l'ADN avec les enzymes TETs. TDG humaine est également capable d'initier une voie de BER aberrante en excisant la thymine appariée à une adénine endommagée dans le contexte de la séquence TpG/CpX, où X est une adénine modifiée. L'acide aristolochique, un composé trouvé dans des plantes médicinales chinoises, est activé par des nitroréductases cellulaires, ce qui entraîne la formation des adduits de 7-(désoxyadénosine-N6yl) aristolactame (dA-ALI et dA-ALII) dans l'ADN cellulaire. Des études récentes sur le cancer induit par d'acides aristolochiques ont identifié des transversions de T→A multiples dans le contexte de séquence CpTpG/CpApG, qui ressemble fortement au contexte préféré pour l'excision aberrante de T par TDG dans le duplex endommagé T•X. Étant donné que les adduits dA-AL ne sont pas réparés sur le brin d'ADN non transcrit et peuvent donc persister dans les cellules, nous avons émis l'hypothèse d'une possible implication de TDG dans la mutagénèse induit par l'acide aristolochique.Pour étudier cela nous avons reconstitué la réparation in vitro en utilisant des oligonucléotides contenant dA-AL marqués de manière radioactive. De manière inattendue, après une incubation prolongée à 37 °C, l'enzyme TDG de longueur complète (TDGFL) a montré une activité glycosylase envers les bases C et T normales appariées avec G et A, respectivement, plutôt que T appariée aux adduits dA-AL. TDG cible préférentiellement les pyrimidines non endommagées dans un duplex d'ADN régulier dans les contextes TpG/CpA et CpG/CpG, ce que nous avons appelé « réparation futile ». La cinétique de réparation en conditions de turnover unique montre que le taux maximal d'excision de base (kobs) de T dans le duplex T•A (0.0014 min-1) catalysé par TDGFL est 300 fois plus lent que pour T•G (0,470 min-1). Notamment, TDGFL native, mais non le domaine catalytique tronqué TDG (TDGCAT), a montré une stabilité accrue à 37°C en présence de concentrations équimolaires de duplex d'ADN non spécifiques, suggérant que les domaines désordonnés N- et C-terminaux de la protéine TDG interagissent avec l'ADN, stabilisant ainsi la conformation de la protéine. De plus, nous avons montré que 5mC n'est pas excisée par TDGFL, tandis que 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), au contraire, est excisée aussi bien que la cytosine normale dans le contexte CpG. Ces résultats suggèrent un rôle possible de TDG dans la génération de cassures monocaténaires (SSB) dans les enhancers (amplificateurs) des cellules neuronales postmitotiques, un processus qui pourrait contribuer aux maladies neurodégénératives, car les cassures ont été principalement observées à proximité des sites de déméthylation de l'ADN et des îlots CpG. En conclusion, nos résultats démontrent que dans des conditions expérimentales, TDGFL catalyse la réparation futile des résidus de pyrimidine dans les duplex d'ADN réguliers dépendante du contexte de séquence, ce qui, dans des conditions in vivo, pourrait conduire à la formation persistante de SSB dans les régions non méthylées de l'ADN chromosomique. La découverte de la réparation lente des résidus 5hmC dans l'ADN par la voie TDG/BER est l'un des principaux points d'intérêt pour les études et perspectives futures.

Background: Consumption of aristolochic acids (AA) from the plant Aristolochia results in the formation of bulky aristolactam-dA (dA-AL) and aristolactam-dG (dG-AL) adducts in cellular DNA ultimately leading to the development of urothelial cancer. Intriguingly, the dA-AL adducts induce A•T→T•A transversions in tumor cells preferentially in CpA*→TpG context. The human mismatch-specific thymine-DNA glycosylase (TDG) protects cells against mutagenesis induced by spontaneous deamination of 5-methylcytosine (5mC) by removing thymine opposite to guanine in a CpG context in the base excision repair (BER) pathway. Nevertheless, challenges for DNA glycosylases to the faithful discrimination between non-damaged and damaged DNA strands do exist, such as mismatched pairs between two canonical bases, which may result due to DNA polymerase errors during replication. Previously, we demonstrated that TDG is prone to aberrant excision of T opposite to damaged adenine in duplex DNA in CpA*/TpG context. Methods: In the present work, using in vitro reconstitution assays, we investigated whether TDG participates in the aberrant removal of thymine opposite to dA-AL adducts in duplex DNA. Results: We have demonstrated that TDG either does not excise thymine or does so with extremely low efficiency when it is paired with dA-AL or dG-ALII adducts in duplex DNA. At the same time, TDG excises with high efficiency thymine opposite to guanine and hypoxanthine in T•G and T•Hx mispairs. Discussion: These findings strongly suggest that the human TDG is not involved in the aberrant DNA repair of AA-induced DNA damage.