Felix Lehmann

Kurzzusammenfassung: Die Kompartimentierung biosynthetischer Wege stellt ein zentrales Ziel des Proteinengineerings dar, insbesondere in der synthetischen Biologie und bei der Optimierung komplexer Stoffwechselwege. Hier kann die Kompartimentierung die katalytische Effizienz steigern, reaktive Zwischenprodukte stabilisieren, die Bildung von Nebenprodukten verringern und darüber hinaus durch die Koordination mehrstufiger Reaktionen eine erhöhte synthetische Komplexität ermöglichen. In dieser Studie wurde eine chemo‐enzymatische Plattform zur Biosynthese von 2‐Pyronen – insbesondere Styrylpyrone und Hispidin – in einem Multienzym etabliert, das auf einer nicht‐reduzierenden (nr) Variante der murinen Fettsäuresynthase (FAS) basiert, welche natürlicherweise Palmitinsäure produziert. Durch die Einführung von zwei gezielten Aminosäuresubstitutionen in der Ketosynthase‐Domäne (KS), wurde die nrFAS‐vermittelte Synthese von Styrylpyronen aus nicht‐kanonischen Substraten, einschließlich halogenierter Derivate, verbessert. Das angepasste Enzym zeigte eine 66‐fach höhere katalytische Aktivität im Vergleich zur nicht‐mutierten nrFAS und übertraf dabei die Styrylpyronsynthase des Kavalacton‐Biosynthesewegs aus Piper methysticum . Darüber hinaus wurde ein 4‐Cumarat‐Ligase (4CL1) Lademodul mithilfe des SpyTag/SpyCatcher‐Systems in das Kompartiment integriert, wodurch die Aktivierung und direkte Übertragung von Zimtsäurederivaten auf die nrFAS ermöglicht wurde. Die resultierenden Styrylpyrone dienen als direkte Vorläufer pharmakologisch aktiver Kavalactone, während Hispidin als Vorläufer der Pilz‐Biolumineszenz fungiert.

Compartmentalizing biosynthetic pathways is a key objective in protein engineering, particularly in synthetic biology and metabolic engineering. It can improve catalytic efficiency, stabilize reactive intermediates, reduce by‐product formation, and, beyond these advantages, enable synthetic complexity by coordinating multistep pathways. In this study, we established a chemoenzymatic platform for producing 2‐pyrones—specifically styrylpyrones and hispidin—within a multienzyme based on a non‐reducing (nr) variant of the murine fatty acid synthase (FAS), which naturally produces palmitic acid. By introducing two amino acid substitutions in the ketosynthase (KS) domain, we enhanced the nrFAS‐mediated synthesis of styrylpyrones from non‐native substrates, including halogenated derivatives. The engineered enzyme exhibited a 66‐fold increase in activity compared to the non‐mutated nrFAS, surpassing the styrylpyrone synthase of the kavalactone pathway in Piper methysticum . Additionally, we integrated a 4‐coumarate ligase (4CL1) loading module into the compartment using the SpyTag/SpyCatcher system, enabling the activation and direct transfer of cinnamic acid derivatives to the nrFAS. The resulting styrylpyrones are direct precursors of pharmaceutically active kavalactones, while hispidin serves as the precursor of fungal bioluminescence.