Nawel Zaibi

ORAI channels are store-operated Ca²⁺ channels, which play important roles in physiology and pathophysiology. ORAI channel modulators are useful for developing pharmacological interventions. Here, we aimed to investigate the benzhydryl-derived analogues as novel ORAI channel blockers. The effects of benzhydryl-derived analogues TH1177, clemastine, cloperastine, and diphenhydramine were investigated in HEK-293 cells overexpressing individual ORAI isoforms and STIM1. The ORAI currents were recorded by patch-clamp, and cytosolic Ca²⁺ was measured by a fluorescent Ca²⁺ dye. TH1177 inhibited ORAI1, ORAI2, and ORAI3 currents with IC₅₀ values of 18.3 μM, 4.8 μM, and 35.6 μM, respectively. Clemastine inhibited ORAI1 and ORAI2, but showed no effect on ORAI3. Both cloperastine and diphenhydramine, without a pyrrolidine ring structure, only showed minimal inhibition of ORAI1. Intracellular application of TH1177 and outside-out patch demonstrated that TH1177 blocked ORAI3 currents via the extracellular surface. TH1177 did not affect cytosolic STIM1 clustering and movement. Moreover, TH1177 potently inhibited cell proliferation with IC₅₀ values of 2.6 µM for HAEC, 5.2 µM for EA.hy926, and 29.4 µM for HK-2 cells and induced apoptotic cell death. It is concluded that TH1177 is a pan-inhibitor for ORAI1-3 channels, while clemastine inhibits ORAI1 and ORAI2 but shows little effect on ORAI3. The pyrrolidine ring structure in the compounds of TH1177 and clemastine is critical for their inhibitory activity. The two benzhydryl derivatives (cloperastine and diphenhydramine) without the pyrrolidine ring only showed minimal inhibition of ORAI1. Our findings give a new pharmacological profile of ORAI channels.

Objectifs : L'incidence du diabète de type 2 (DT2) augmente chez les patients atteints de maladie rénale chronique (MRC) quand le taux de filtration glomérulaire diminue, suggérant une corrélation physiopathologique entre la réduction de la fonction rénale et l'homéostasie du glucose. L'acidose métabolique (AM) est un symptôme commun de la MRC qui se développe quand le taux de filtration glomérulaire est inférieur à 60mL/min/1.73m2. L'AM est causée par une diminution de la capacité d'excrétion d'acide entrainant une augmentation de la charge acide et une diminution de la concentration plasmatique de bicarbonate. Des études sur l'AM aigüe ont montré une diminution de la tolérance au glucose et de la sensibilité à l'insuline. Par contre, les effets de l'AM chronique sur l'homéostasie du glucose sont peu connus. Méthodes : Nous avons évalué l'homéostasie du glucose chez la souris présentant une acidose métabolique chronique par administration de 0.28 M de NH4Cl sur une durée de 6 mois. Les altérations rénales ont été étudiées par des approches complémentaires : histologie, tri cellulaire et analyse transcriptomique. Nous avons également caractérisé le phénotype métabolique de notre modèle souris ainsi que les voies de signalisation et mécanismes impliquées dans la dérégulation rénale chez nos souris acidosiques. Résultats : Contrairement à l'AM aigüe, l'AM chronique entraine une baisse du poids corporel, une augmentation de la dépense énergétique et une hypoglycémie basale chez la souris. L'AM chronique améliore la tolérance au glucose sans modification de la sécrétion ou de la sensibilité à l'insuline. La capture corporelle de glucose globale ne semble pas altérée. Une diminution de la néoglucogenèse hépatique est observée chez les souris acidosiques. Par contre, la néoglucogenèse rénale et intestinale est augmentée. La concentration de glucose urinaire chez les souris acidosiques est augmentée. Cette observation est corrélée avec une diminution de l'expression des co-transporteurs de sodium/glucose dans le tubule proximal et des altérations morphologiques des tubules sans fibrose ni inflammation visible. Le séquençage d'ARN du transcriptome entier dans le rein a montré une forte augmentation des voies cellulaires impliquées dans la régulation de l'activité mitochondriale, du métabolisme oxydatif et dans le catabolisme global des souris acidosiques. Conclusion : L'acidose métabolique chronique entraine une augmentation de la tolérance au glucose, sans modification de la sécrétion et de la sensibilité à l'insuline. Ceci pourrait être due, au moins en partie, à une réduction de la production endogène de glucose hépatique et de la réabsorption de glucose urinaire, associée à une augmentation globale de la demande énergétique comme observée dans le rein.

Background and Purpose: Mibefradil, a T‐type Ca²⁺ channel blocker, has been investigated for treating solid tumours. However, its underlying mechanisms are still unclear. Here, we have investigated the pharmacological actions of mibefradil on Orai store‐operated Ca²⁺ channels.Experimental Approach: Human Orai1‐3 cDNAs in tetracycline‐regulated pcDNA4/TO vectors were transfected into HEK293 T‐REx cells with stromal interaction molecule 1 (STIM1) stable expression. The Orai currents were recorded by whole‐cell and excised‐membrane patch clamp. Ca²⁺ influx or release was measured by Fura‐PE3/AM. Cell growth and death were monitored by WST‐1, LDH assays and flow cytometry.Key Results: Mibefradil inhibited Orai1, Orai2, and Orai3 currents dose‐dependently. The IC₅₀ for Orai1, Orai2, and Orai3 channels was 52.6, 14.1, and 3.8 μM respectively. Outside‐out patch demonstrated that perfusion of 10‐μM mibefradil to the extracellular surface completely blocked Orai3 currents and single channel activity evoked by 2‐APB. Intracellular application of mibefradil did not alter Orai3 channel activity. Mibefradil at higher concentrations (>50 μM) inhibited Ca²⁺ release but had no effect on cytosolic STIM1 translocation evoked by thapsigargin. Inhibition on Orai channels by mibefradil was structure‐related, as other T‐type Ca²⁺ channel blockers with different structures, such as ethosuximide and ML218, had no or minimal effects on Orai channels. Moreover, mibefradil inhibited cell proliferation, induced apoptosis, and arrested cell cycle progression.Conclusions and Implications: Mibefradil is a potent cell surface blocker of Orai channels, demonstrating a new pharmacological action of this compound in regulating cell growth and death, which could be relevant to its anti‐cancer activity.