Xavier Kubiak

ZUSAMMENFASSUNG: G‐Protein‐gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind an den meisten physiologischen Prozessen im Menschen beteiligt. Sie stellen eine der größten Proteinfamilien dar, über die eine Vielzahl zugelassener Medikamente wirken. Heterotrimere Gαβɣ‐Proteine binden über die C‐terminale α5‐Helix der Gα‐Untereinheit (GαCT) an die intrazelluläre Bindungsstelle des aktiven Rezeptors. Die Modulation der GPCR‐Aktivität über diese intrazelluläre GPCR‐Bindungsstelle stellt daher eine neue und vielversprechende Forschungsrichtung dar. In dieser Arbeit wurden hochaktive, von Gα _s CT abgeleitete Peptidomimetika entwickelt, die den β ₂ ‐Adrenorezeptor (β ₂ AR) in einer aktiven Konformation stabilisieren. Zu diesem Zweck wurde zunächst die helikale Konformation von GαsCT durch eine kovalent verankerte Brücke stabilisiert. Durch rationales Design, bei dem Informationen aus zwei Kristallstrukturen mit unterschiedlichen Bindungsmodi von Gα _s CT an β ₂ AR integriert wurden, konnte eine geeignete Position für die Verankerung der Brücke identifiziert werden. Um die Aktivität von GαsCT weiter zu verbessern, wurden die Schlüsselinteraktionen der beiden β ₂ AR‐Strukturen (β ₂ AR‐Gs(leer) und β ₂ AR‐T4L‐GsCT‐CC), nämlich Y391 und E392, durch nicht‐kanonische Aminosäuren ersetzt. Diese Optimierung führte schließlich zur Identifizierung eines potenten Peptidomimetikums, das in der Lage ist, die aktive Rezeptorkonformation zu stabilisieren und gleichzeitig die rezeptorvermittelte cAMP‐Bildung zu blockieren. Die mithilfe von Molekulardynamik‐Simulationen ermittelten Bindungsmuster des Peptidomimetikums an den Rezeptor deuten auf einen Zwischenzustand hin, der dem durch β ₂ AR‐Gs(leer) repräsentierten nukleotidfreien Zustand vorausgeht. Wir gehen davon aus, dass dieser Ansatz für die weitere strukturelle und funktionelle Erforschung anderer GPCRs oder als Werkzeug der Wirkstoffforschung von Nutzen sein wird.

G protein‐coupled receptors (GPCRs) are involved in most human physiological processes and one of the largest families of approved drug‐targeted proteins. Heterotrimeric Gαβɣ proteins bind to the intracellular cavity of the activated receptor mainly through the C‐terminal α5 helix of the Gα subunit (GαCT). Modulation of GPCR activity through intracellular GPCR binding sites is emerging. Here we develop highly active Gα _s CT‐derived peptidomimetics that stabilize the β ₂ adrenergic receptor (β ₂ AR) in an active‐like conformation when the helical conformation of Gα _s CT is preserved by a covalent tether (“staple”). By rational design, integrating the information of two crystal structures showing different binding modes of Gα _s CT with β ₂ AR, an appropriate staple position was identified. The key interactions observed in the two distinct β ₂ AR structures (β ₂ AR‐G _s (empty)) and β ₂ AR‐T4L‐G _s CT‐CC), namely Y391 and E392, were substituted with non‐canonical amino acids to improve activity. Optimization resulted in the identification of a potent peptidomimetic capable of stabilizing an active‐like receptor conformation, whilst blocking receptor‐mediated cAMP formation. Molecular dynamics simulations indicated a peptidomimetic binding mode that may represent another intermediate state preceding that of β ₂ AR‐G _s (empty). We envision this approach to be useful for further structural and functional exploration of other GPCRs or as a tool in drug discovery.